Baca: Waters Column
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah metode kromatografi cair dengan menggunakan kolom untuk memisahkan komponen dalam sampel berdasarkan ukuran, interaksi, dan distribusi komponen tersebut dalam cairan. Pada proses HPLC, sampel melewati kolom dengan bantuan pompa dan fasa gerak. Ketika sampel melewati kolom, komponen-komponennya akan terpisah berdasarkan interaksinya dengan fase diam (kolom) dan fase gerak. Komponen yang memiliki interaksi yang kuat dengan fase diam (kolom) akan terakumulasi di kolom dan terdeteksi lebih lambat, sedangkan komponen yang memiliki interaksi yang lemah akan terdeteksi lebih cepat.
Secara umum kolom terbuat dari silika gel yang dimampatkan. Silika gel dipilih karena ukuran partikel dan bersifat inert (tidak bereaksi) dengan fase gerak. Ada beberapa tipe kolom yang dapat digunakan dalam HPLC. Tipe kolom yang digunakan akan tergantung pada kebutuhan spesifik dari analisis, termasuk sifat-sifat senyawa yang dianalisis dan metode pemisahan yang diinginkan.
Beberapa tipe kolom yang sering digunakan dalam HPLC adalah:
Kolom fase normal: Kolom ini biasanya digunakan untuk pemisahan senyawa hidrofobik (tidak larut dalam air). Mereka terbuat dari fase diam polar, seperti silika, dan fase mobile non-polar, seperti pelarut organik.
Saat campuran senyawa melewati kolom fase normal, senyawa-senyawa akan terikat pada fase diam dan terpisah dari satu sama lain berdasarkan interaksi dengan fase diam. Senyawa yang lebih polar akan lebih kuat terikat pada fase diam dan akan melewati kolom dengan kecepatan yang lebih lambat dibandingkan dengan senyawa yang kurang polar. Dengan demikian, senyawa-senyawa polar akan terpisah dari senyawa non-polar, memungkinkan pemisahan yang efektif.
Kolom fase normal sering digunakan dalam analisis senyawa organik, seperti obat-obatan, makanan, minuman, dan bahan kimia lainnya. Pemilihan pelarut yang tepat untuk fase mobile sangat penting dalam menentukan efektivitas pemisahan yang diinginkan.
Kolom fase terbalik: Kolom ini digunakan untuk pemisahan senyawa hidrofilik (larut dalam air). Mereka terbuat dari fase diam non-polar, seperti silika yang diikat dengan hidrokarbon, dan fase mobile polar, seperti air atau pelarut akuatik.
Saat campuran senyawa melewati kolom fase terbalik, senyawa-senyawa akan terikat pada fase diam dan terpisah dari satu sama lain berdasarkan interaksi dengan fase diam. Senyawa yang lebih non-polar akan lebih kuat terikat pada fase diam dan akan melewati kolom dengan kecepatan yang lebih lambat dibandingkan dengan senyawa yang lebih polar. Dengan demikian, senyawa non-polar akan terpisah dari senyawa polar, memungkinkan pemisahan yang efektif.
Kolom fase terbalik sering digunakan dalam analisis senyawa organik polar, seperti asam amino, nukleotida, dan polisakarida. Ini juga dapat digunakan dalam analisis protein dan senyawa anorganik polar, seperti garam. Pemilihan pelarut yang tepat untuk fase mobile sangat penting dalam menentukan efektivitas pemisahan yang diinginkan.
Kolom pertukaran ion: Kolom ini digunakan untuk pemisahan ion atau molekul yang bermuatan. Mereka terbuat dari fase diam dengan kelompok bermuatan, seperti kelompok sulfonat atau karboksilat, dan fase mobile dengan muatan berlawanan.
Saat campuran senyawa melewati kolom pertukaran ion, senyawa-senyawa akan terikat pada fase diam dan terpisah dari satu sama lain berdasarkan interaksi dengan fase diam. Senyawa dengan muatan yang sama akan lebih kuat terikat pada fase diam dan akan melewati kolom dengan kecepatan yang lebih lambat dibandingkan dengan senyawa dengan muatan yang berlawanan. Dengan demikian, senyawa dengan muatan yang sama akan terpisah dari senyawa dengan muatan yang berlawanan, memungkinkan pemisahan yang efektif.
Kolom pertukaran ion sering digunakan dalam analisis senyawa anorganik seperti garam. Ini juga dapat digunakan dalam analisis protein dan senyawa-senyawa lain yang memiliki muatan. Pemilihan pelarut yang tepat untuk fase mobile sangat penting dalam menentukan efektivitas pemisahan yang diinginkan.
Kolom ukuran pori: Kolom ini digunakan untuk pemisahan molekul berdasarkan ukurannya. Mereka terbuat dari fase diam dengan pori-pori ukuran tertentu, dan molekul dipisahkan saat melewati pori-pori berdasarkan ukurannya.
Saat campuran senyawa melewati kolom ukuran pori, senyawa-senyawa akan terpisah dari satu sama lain berdasarkan ukurannya. Molekul dengan ukuran yang lebih kecil akan lebih mudah masuk ke dalam pori-pori fase diam dan akan melewati kolom dengan kecepatan yang lebih lambat dibandingkan dengan molekul dengan ukuran yang lebih besar. Dengan demikian, molekul dengan ukuran yang lebih kecil akan terpisah dari molekul dengan ukuran yang lebih besar, memungkinkan pemisahan yang efektif.
Kolom ukuran pori sering digunakan dalam analisis polisakarida. Ini juga dapat digunakan dalam analisis senyawa organik dan anorganik lainnya yang memiliki ukuran yang berbeda. Pemilihan pelarut yang tepat untuk fase mobile sangat penting dalam menentukan efektivitas pemisahan yang diinginkan.
Penggunaan jenis kolom yang tepat dalam HPLC sangat penting untuk mencapai hasil yang akurat dan berkualitas. Kolom yang digunakan harus memiliki diameter yang sesuai dengan ukuran partikel media pengikat yang digunakan, sehingga dapat menghasilkan resolusi yang tinggi. Selain itu, kolom yang digunakan juga harus memiliki stabilitas yang baik dan tahan terhadap pengaruh lingkungan selama proses pemisahan. Jika kolom yang digunakan tidak sesuai dengan kondisi yang diinginkan, maka hasil analisis yang diperoleh dari HPLC tidak akan maksimal dan dapat mengakibatkan kesalahan dalam interpretasi data.
Dalam HPLC, kolom yang digunakan harus memenuhi beberapa kriteria untuk menjamin hasil yang akurat dan berkualitas. Pertama, kolom yang digunakan harus memiliki stabilitas yang baik agar dapat digunakan dalam jangka waktu yang lama. Kedua, kolom yang digunakan harus dapat menahan tekanan yang tinggi selama proses pemisahan, karena tekanan yang tinggi dapat meningkatkan kecepatan pemisahan senyawa-senyawa dalam sampel. Ketiga, kolom yang digunakan harus memiliki kemampuan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam sampel dengan resolusi yang tinggi, sehingga dapat menghasilkan data yang akurat dan dapat diinterpretasikan dengan baik. Keempat, kolom yang digunakan harus memiliki kemampuan untuk menahan berbagai macam senyawa kimia yang mungkin ada dalam sampel, agar dapat digunakan untuk berbagai macam aplikasi analisis kimia.