High Performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah metode kromatografi cair yang digunakan untuk memisahkan dan menganalisis komponen dalam sampel. Metode ini menggunakan cairan sebagai fase gerak untuk memisahkan komponen dalam sampel, dan menggunakan kolom sebagai media untuk memisahkan komponen dalam sampel berdasarkan ukuran, interaksi, dan distribusi komponen tersebut dalam cairan.
HPLC biasanya digunakan untuk menganalisis bahan-bahan kimia, seperti obat-obatan, pestisida, bahan makanan, dan bahan kimia lainnya. Metode ini juga banyak digunakan dalam industri farmasi, makanan, reasearch dan pemerintahan.
HPLC memiliki beberapa keunggulan dibandingkan dengan metode kromatografi lainnya, seperti kromatografi gas (GC) dan kromatografi lapis tipis (TLC). Keunggulan-keunggulan tersebut antara lain:
– Aplikasi luas untuk berbagai jenis senyawa seperti;
– Polar, non polar, asam, basa dan netral.
– Senyawa yang tak stabil terhadap temperatur.
– Senyawa makromolekul: polimer/plastik, protein, nukleotida dan karbohidrat.
– Banyak pilihan dalam pengembangan metode
– Banyak pilihan kolom
– Banyak pilihan fasa gerak
– Analisis kualitatif dan kuantitatif
– Ketepatan dan ketelitian tinggi
– Dapat untuk analisis dan pemurnian/isolasi
Cara Kerja
Untuk melakukan analisis dengan HPLC, sampel pertama-tama harus disiapkan dengan cara dilarutkan dalam cairan. Sample diinjeksikan ke dalam injektor untuk selanjutnya akan melewati kolom dengan bantuan pompa dan fasa gerak. Ketika sampel melewati kolom, komponen-komponennya akan terpisah berdasarkan interaksinya dengan medium kromatografi dan fase gerak. Komponen yang memiliki interaksi yang kuat dengan medium kromatografi akan terakumulasi di kolom dan terdeteksi lebih lambat, sedangkan komponen yang memiliki interaksi yang lemah akan terdeteksi lebih cepat.
Setelah melewati kolom, komponen-komponennya akan dibaca serapannya oleh detektor. Jenis detektor yang terdapat di HPLC yaitu detektor UV-Vis, Photo Diode Array Detektor (PDA), Fluoroscence, Conductivity, Evaporated Light Scattering Detector (ELSD), Electro Chemical Detector (ECD), Refractive Index Detector dan Mass Spectrometry. Detektor yang paling umum digunakan adalah detektor UV-Vis, Detektor ini digunakan untuk mendeteksi komponen yang memiliki gugus aromatik atau gugus lain yang menyerap cahaya pada panjang gelombang yang spesifik.
Hasil serapan yang dibaca dari detektor diterjemahkan oleh software menjadi bentuk kromatogram. Kromatogram adalah grafik yang menampilkan waktu retensi komponen, dengan intensitas sinyal detektor sebagai sumbu Y. Kromatogram dapat digunakan untuk menentukan identitas, konsentrasi, dan kemurnian komponen dalam sampel.
Dalam penggunaan HPLC, beberapa faktor yang perlu diperhatikan adalah kondisi kolom, kecepatan fase gerak, dan pH fase gerak. Kondisi kolom yang baik dapat membantu meningkatkan resolusi dan reproduksibilitas hasil analisis. Kecepatan fase gerak yang tepat dapat membantu meningkatkan kecepatan analisis, sedangkan pH fase gerak yang tepat dapat membantu meminimalkan interaksi antara komponen dalam sampel dengan fase gerak.
Selain itu, metode kalibrasi dan validasi juga perlu dilakukan untuk menjamin keakuratan dan ketepatan hasil analisis. Metode kalibrasi digunakan untuk menentukan kurva kalibrasi dari detektor, sedangkan metode validasi digunakan untuk mengevaluasi ketepatan dan kehandalan metode analisis. Secara keseluruhan, HPLC merupakan metode analisis yang bermanfaat untuk memisahkan dan menganalisis komponen dalam sampel dengan tingkat keakuratan dan ketepatan yang tinggi. Apabila Anda ingin mengetahui lebih lanjut terkait dengan HPLC dan berbagai Liquid Chromatography lainnya, bisa mengunjungi halaman berikut (klik di sini)